腫瘤君，聽說你最近又暴露了不少！
近日，多項與液體活檢相關的重要研究成果陸續公布，讓人大呼過癮。英國劍橋大學科學家通過體外富集一定長度的cfDNA來提高ctDNA分析準確性（Science Translational Medicine）；盧煜明教授團隊發現，ctDNA片段除了長度偏小之外，其末端位置也同樣具有一定特征（PNAS）；加拿大研究團隊另辟蹊徑，利用新型的cfMeDIP甲基化檢測技術，在小樣本中實現了某些癌癥的早期準確診斷（Nature）。除此之外，還有兩項里程碑式的成果，斯坦福大學的Howard Y. Chang教授團隊繪制了目前最為全面的癌癥染色質可及性圖譜（Science）；Nature Biotechnology也報道了一種可以克服Bisulfite損傷的新型表觀修飾檢測技術——ACE-seq。
ctDNA是來自腫瘤基因組的碎片，其在癌癥診療中的作用無需多言。目前，我們已經發現了ctDNA的多個特征（圖1），并將其分為兩類：一類是在基因組層面；另一類屬于表觀層面，例如核小體占位（Size/End）和堿基修飾（甲基化、羥甲基化等）。不難發現，上述研究其實都聚焦在表觀組學標志物上。那么，表觀標志物與基因組標志物的研究有什么不同？這些研究的出發點是什么？又想解決哪些問題？為了回答這些問題，小編總結了幾個關鍵詞：Size selection、PCR-free和Single cell和BS-free。接下來，我們就圍繞這些關鍵詞，系統地回顧一下上述研究的來龍去脈。
圖1. 腫瘤特異的基因組和表觀組學標志物[1]
對于Size selection，為什么要進行片段分選？因為此前研究發現，與正常細胞的cfDNA相比，ctDNA會普遍小一些。通過體外實驗手段，研究人員富集了ctDNA片段分布最為集中、cfDNA濃度較低的區域，以此提高ctDNA的相對濃度（90~150bp），并利用富集后的DNA分析ctDNA的CNV和SNV，進而大大提高了準確性[2]。
圖2. 體外Size selection提高ctDNA的CNV靈敏度[2]
不過，需要注意的是，對cfDNA進行體外篩選可能會導致樣品污染，這也是不少研究人員的顧慮[6]。此外，從圖3我們可以看到，片段分選在本質上是以犧牲部分ctDNA為代價來提高其相對濃度。所以,研究人員也在報道中強調，體外篩選可能會導致某些ctDNA信息的丟失[2]。而早期腫瘤的ctDNA少之又少，因此是否進行體外選擇仍需慎重。
圖3. cffDNA和ctDNA的片段分布特點[2,5]
一個有意思的問題是，cffDNA和ctDNA為什么都會偏??？研究人員一般認為，如果核小體上的DNA纏繞變得松弛，核酸內切酶就更易接近并發生剪切，也就產生了更小的DNA片段[8]，這也在一定程度上反映了染色質的開放程度，暗示著更高的轉錄活性（圖4）。
圖4. 白細胞和胎盤組織的ATAC-seq結果以及核小體DNA切割示意圖[8]
實際上，在很多年以前，科學家們就已經通過分析Y染色體序列（cffDNA）或少數攜帶體細胞突變的片段（ctDNA），分別觀測到cffDNA和ctDNA的片段長度更短的現象[3,4]。在高通量測序技術（NGS）出現后，科學家才進一步確認了這一現象，并嘗試用于NIPT和液體活檢[2,5,6,7]。那么，究竟是哪些因素限制了cfDNA片段特征的研究呢？
通常，我們先利用體細胞突變區分ctDNA和cfDNA，然后再去觀測這些ctDNA的片段分布。而問題恰恰就出在了體細胞突變上，主要是由于體細胞突變鑒定方法的限制?！癠MI-PCR+Panel+超高深度測序”這套技術是體細胞突變鑒定的常用方法，鑒定到的突變自然而然也只能出現在Panel的基因中。這種利用基因Panel探索基因組標志物，進而開展表觀修飾研究的思路便存在一定局限性。換句話說，我們只能標記并觀測非常局部的ctDNA片段（圖5）。
圖5. 技術的進步讓我們開始觀測到全基因組范圍的體細胞變異（冰山底部）[9]
在不借助UMI-PCR的情況下，如何矯正測序錯誤并權衡成本，實現全基因組的低頻突變鑒定呢？盧煜明教授團隊發現ctDNA偏好末端，正是得益于一種全新的Error-corrected NGS技術——“PCR-free+WGS+動態閾值分析”[11]。該技術首先在cffDNA片段末端研究中嶄露頭角[10]。研究人員借助PCR-free技術矯正PCR錯誤，利用高深度WGS測序（195~270x）配合動態閾值分析去除測序儀錯誤后，他們驚奇地發現，cffDNA的片段除了長度更短之外，往往還具有相同的末端位置（圖6）。PCR擴增是測序數據偏好的主要來源，研究人員認為，此前之所以沒有觀測到這一現象，主要因為PCR偏好掩蓋了真相；同時，研究中測序的深度也是之前研究從未達到的。
圖6. “PCR-free+WGS+動態閾值”分析技術探究cffDNA片段特征[10]
現在，他們將這套檢測方法運用到了肝癌的ctDNA分析中。果不其然，ctDNA也具有明顯的偏好末端[11]。值得注意的是，相較于常規UMI+Panel的ctDNA鑒定方法，全新的Error-corrected NGS技術進一步擴大了突變的篩選范圍，使得偏好末端或size標志物觀測不僅僅局限于腫瘤的突變熱點基因區域。最終，研究人員發現了大量ctDNA的偏好末端。這些偏好末端主要出現在基因間區（58%）和基因區（39%）[11]，這使開發更為經濟的綜合性ctDNA檢測技術成為了可能。
對于cfDNA片段標志物的篩選，上述研究可以理解為順藤摸瓜、追本溯源的鑒定方式，即從已經被切割成cfDNA的片段中找尋規律。但現在，我們還沒有足夠的標志物能夠精確地將不同組織來源的cfDNA統統區分開來，所以也不能清晰地分析出它們在血漿中的特征。實際上，回到組織源頭，每種組織甚至每個細胞都具有獨特的表觀調控模式，腫瘤內部的異質性更是將表觀特征的多樣性推向了極致。所以，通過Single cell表觀測序分析，更為真實地還原腫瘤細胞群特有的全景表觀調控模式，將為我們理解血漿中ctDNA的片段特征提供更多的參考（癌癥染色質可及性圖譜，Science）。似乎，科學家們已經開始探索冰山底部的秘密了（圖5. PCR-free Error-corrected WGS/Single-cell ATAC-seq）。
有趣的是，最后的兩項研究很有緣分，他們都不約而同地向著同一個目標進發——BS-free（圖7）。在癌癥甲基化早篩研究中，Bisulfite儼然成為了“全民公敵”，BS-free技術也一直是研究者夢寐以求的“神器”。在題為“Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes”的Nature文章中，研究人員通過加入carrier DNA提升了IP效率，使得優化后的cfMeDIP技術可以對cfDNA實現BS-free檢測；Nature Biotechnology報道的ACE-seq則是利用酶學轉化原理替換Bisulfite的化學轉化。兩篇文章可謂具有異曲同工之妙。
圖7. 兩種檢測DNA表觀修飾的BS-free技術[12,13]
目前，表觀修飾研究大多遵循兩種思路：一種是基于識別甲基化DNA的抗體或結合蛋白，不需要對DNA進行額外的處理；另一種，是需要加入示差試劑對DNA進行處理，以區分C和mC，比如“萬惡”的Bisulfite。在小編看來，兩種方法各有優劣。前者過于依賴抗體的性能，也不能達到單堿基分辨率，但他最大的優勢就是無傷，這恰恰是后一類方法的痛點。而ACE-seq可謂在千呼萬喚、萬眾期盼的情形下登場的?；诿笇W處理的ACE-seq可將DNA的損傷降到最低，在提升檢測靈敏度的同時，還保留了DNA的完整性，利于檢測cfDNA的其他特征。ACE-seq不論是在組織、單細胞，還是游離DNA的表觀修飾分析中，都具有非常廣闊的應用前景。
結 語
近期的多項研究進展確實令人振奮，這也使我們離真相越來越近。但科學家們仍清楚地認識到，人類對腫瘤基因的認知還僅僅是冰山一角。就像最近Nature Review Genetics綜述中提到的[1]，我們現在連cfDNA的真實組成都還沒有完全確認。它們真的主要來源于白細胞嗎？如果不是，使用白細胞作為背景突變對照可能是存在漏洞的。此外，之前爆出的不同檢測機構的腫瘤基因檢測結果差異巨大，到底是腫瘤異質性的真實反映還是技術的限制？在真正“馴服”ctDNA之前，我們仍有很多基本的生物學問題尚待回答。
參考文獻：
1. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics- driven oncology. 2018NRG
2. Enhanced detection of circulating tumor DNA by fragment size analysis. 2018 Science Translational Medicine
3. Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma. 2004 Clinical Chemistry
4. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. 2005 PNAS
5. Maternal Plasma DNA Sequencing Reveals the Genome-Wide Genetic and Mutational Profile of the Fetus. 2010 Science Translational Medicine
6. Fragment Length of Circulating Tumor DNA. 2016 Plos Genetics
7. Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for noninvasive prenatal testing. 2014 PNAS
8. Size-tagged preferred ends in maternal plasma DNA shed light on the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing. 2018 PNAS
9. Aging and the rise of somatic cancerassociated mutations in normal tissues. 2018 Plos Genetics
10. Second generation noninvasive fetal genome analysis reveals de novo mutations, single-base parental inheritance, and preferred DNA ends.2016 PNAS
11. Preferred end coordinates and somatic variants as signatures of circulating tumor DNA associated with hepatocellular carcinoma. 2018 PNAS
12. Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes. 2018 Nature
13. Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. 2018 Nature Biotechnology
文章來自：微博測序中國
